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本文原载于《中华结核和呼吸杂志》年第4期

本文作者：高永华关伟杰朱亚楠陈荣昌张国俊

支气管扩张症（支扩症）是一种异质性很强的慢性气道炎症，病程中常出现急性加重，严重影响患者的预后及生活质量[1,2]，因此，我国及英国的支扩症指南均将减少急性加重频率作为治疗的重要目标[1,3]。传统的观点认为，细菌（包括细菌的繁殖或菌种的改变）是导致支扩症急性加重的重要因素，流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌是支扩症患者痰液中最常分离的致病菌[4,5]。另外，近期我们通过PCR的方法检测支扩症患者急性加重期鼻部及痰液中的16种常见呼吸道病毒，发现支扩症患者急性加重期病毒检出率为49%，明显高于稳定期患者；最常见的病毒类型为冠状病毒、鼻病毒和流感病毒[6]。考虑到支扩症是一组异质性很强的疾病，病情严重程度不同的患者出现急性加重时的细菌和病毒谱可能不同[2,7,8]，且急性加重期不同的病原谱对患者全身炎症反应及住院率的影响亦不清楚。本研究探讨支扩症急性加重期细菌和病毒谱、不同病情严重程度支扩症患者急性加重期细菌和病毒谱的差异及不同的细菌和病毒谱对全身炎症反应及住院率的影响。现将结果报道如下。对象与方法

一、研究对象

年9月至年3月前瞻性筛选就诊于广州医院呼吸科门诊的例稳定期支扩症患者。入组标准：（1）胸部高分辨率CT（highresolutionCT，HRCT）示支气管扩张并伴有相关的呼吸系统症状，如慢性咳嗽、咳痰等；（2）年龄为18~80岁；（3）稳定期定义：入组前1个月咳嗽、咳痰、呼吸困难等呼吸道症状在日间的正常波动范围，且近1个月内无口服或静脉使用抗生素史；（4）患者能够理解整个研究过程并签署知情同意书。剔除标准：（1）未控制的支气管哮喘；（2）严重的心血管疾病，如心力衰竭、不稳定心绞痛、恶性心律失常等；（3）合并肾脏或肝脏疾病；（4）合并恶性肿瘤；（5）严重肺气肿或纤维化所致的牵拉性支扩症；（6）预期随访困难。按照上述入组和剔除标准，最终例支扩症患者入选，其中男42例，女77例，年龄19~74岁，平均（45±14）岁，随访观察期为1年（截至年6月）。在1年的随访期间，共58例支扩症患者报告了次急性加重事件，男20例，女38例，年龄19~74岁，平均（44±14）岁。对于例纳入随访的支扩症患者和58例发生急性加重事件的支扩症患者，在年龄、性别、体重指数、肺功能、过去1年急性加重次数、过去1年住院次数、HRCT评分及药物治疗等方面比较差异无统计学意义（表1）。在这58例发生急性加重的患者中，轻度、中度和重度患者分别为18、17和25例，在随访过程中分别发生急性加重的次数为25、29和46次，每次急性加重事件均进行痰细菌培养、鼻拭子和痰液病毒检测。

表1例支气管扩张症（支扩症）患者的基线资料

入组时详细采集例支扩症患者的病史，评估患者的病因学、胸部影像学、肺功能及痰细菌培养结果，用PCR方法检测所有患者鼻拭子和痰中的16中常见呼吸道病毒，测定全身炎症因子。在为期1年的随访过程中，记录患者的急性加重情况，并在急性加重期再次进行痰细菌培养，用PCR检测鼻拭子和痰标本中16种常见呼吸道病毒并测定血炎症因子水平。支扩症急性加重的定义为：患者突然出现3种及以上呼吸道症状，包括咳嗽、咳痰（痰量或痰液脓性）、呼吸困难、咯血或胸痛等且持续恶化24h以上并需改变治疗策略（如需要使用口服或静脉抗生素）的急性事件[1,2,6]。所有入组患者均签署知情同意书，本研究获得广州医院伦理委员会批准（年第29号）。

二、研究方法

1．痰细菌培养：

患者来院当天采集足量痰液，选取合格痰液1ml用于细菌培养。合格痰液标本的定义为：每个视野（放大倍数×）下白细胞计数25个，且鳞状上皮细胞计数10个，并进行革兰染色。所有留取的痰液标本2h内接种于血琼脂（法国梅里埃公司，内含5%去纤维蛋白的绵羊血清）和巧克力琼脂培养基（法国梅里埃公司），并将培养基置于含5%二氧化碳的37℃恒温培养箱中隔夜培养，每个培养基至少观察4d。检测的致病菌包括铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌、肠杆菌科细菌等[9]。

2．鼻拭子和痰液中16种常见呼吸道病毒检测：

例稳定期支扩症患者的鼻拭子和痰标本，用核酸提取试剂（德国Qiagen公司）提取标本中的RNA，采用荧光定量PCR技术（日本TAKARA公司TaqMan荧光探针）检测16种常见呼吸道病毒，包括甲型流感病毒（包括年甲型H1N1）、乙型流感病毒、副流感病毒（1~4型）、冠状病毒（E、OC43、NL63和HKU1）、偏肺病毒、人类博卡病毒、呼吸道合胞病毒和鼻病毒（1~4型）[6]。在为期1年的随访观察中，58例支扩症患者报告了次急性加重事件，每次急性加重事件均采集患者的痰液和鼻拭子再次进行PCR病毒检测。对痰液较少或无痰的患者，按照诱导痰试验流程留取诱导痰标本[10]。

3．肺功能检测：

采用意大利柯时迈公司肺功能仪进行肺通气功能检测。操作规程参照美国胸科协会/欧洲呼吸病学会制定的指南[11]：受试者至少测定3次（一般最多不超过8次）肺通气功能，每次用力肺活量（forcedvolumecapacity,FVC）和第一秒用力呼气量FEV1最佳值与次佳值差异应5%或FVCml，然后取患者的最佳肺功能值进行分析。分析的主要肺功能指标包括FEV1、FEV1占预计值%、FVC和FVC占预计值%。

4．炎症因子测定：

在发生急性加重事件时，于次日上午9~12点抽取患者静脉血5ml进行炎症因子测定。血清炎症因子检测采用液相芯片技术，其检测原理与双抗夹心酶联免疫法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）相似，试剂盒（批号：YJFFVE）由美国Bio-Rad试剂公司提供，操作方法按照说明书进行[6]。检测的血清炎症因子包括IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α），同时检测患者的血常规和C反应蛋白水平。

5．支扩症严重程度评价：

采用支扩严重程度指数（bronchiectasisseverityindex,BSI）[2]评估支扩症的病情严重程度，BSI包括年龄、体重指数、FEV1占预计值%、过去1年的急性加重次数、过去2年的住院次数、改良的英国医学委员会呼吸困难评分、细菌定植情况及HRCT评分8个变量，每个变量中针对不同分层的分值不同，总分21分。根据总得分将支扩症分为3级：0~4分为轻度，住院和死亡的风险较低；5~8分为中度，住院和死亡的风险为中等；≥9分为重度，住院和死亡的风险较高。支扩症的HRCT评分主要用来评估支气管扩张的影像学严重程度（柱状型：1分；静脉曲张型：2分；囊状型：3分）及范围（舌叶作为单独一个肺叶，共6个肺叶），最高分为18分，最低分为0分。

三、统计学分析

采用SPSS20.0（美国SPSS公司）与GraphpadPrism6.0（美国Graphpad公司）软件分析数据。对计量指标进行正态性检验，正态分布数据使用均数±标准差，偏态分布数据使用中位数（四分位数）。两组间计量指标的比较用独立样本t检验或非参数检验（正态分布资料采用t检验，偏态分布资料采用非参数检验）；3组或以上计量指标的比较用方差分析或Kruskal-Wallis检验，正态分布资料采用方差分析，偏态分布资料采用Kruskal-Wallis检验。2组或3组计数资料的比较用卡方检验。P0.05定义为差异有统计学意义。

结果

1．急性加重期与稳定期细菌和病毒检出类型：

出现急性加重的58例患者、份痰标本中细菌分离的种类主要为铜绿假单胞菌（35.0%）和副流感嗜血杆菌（41.4%），与稳定期的分离率（9.0%和10.3%）相比差异无统计学意义（χ2值为0.68和0.08，均P0.05）；而病毒感染的检出率明显高于稳定期，差异均有统计学意义（痰液：35.0%和13.8%，χ2=8.3，P=0.；鼻拭子：39.0%和8.6%，χ2=16.9，P0.），痰液中分离的最主要的病毒类型为鼻病毒（14/，13.0%）、冠状病毒（9/，9.0%）和流感病毒（8/，8.0%），鼻拭子中分离的主要病毒为冠状病毒（15/，15.0%）、流感病毒（14/，14.0%）和鼻病毒（10/，10.0%），见表2。

表2急性加重期（例标本）和稳定期（58例标本）支扩症患者病原谱分布（标本数，%）

2．急性加重期细菌和病毒谱及与病情严重程度的关系：

在例次急性加重事件中，根据入组时的BSI评分，25例为轻度支扩症患者，29例为中度支扩症患者，46例为重度支扩症患者。轻度支扩症急性加重期分离出的主要细菌是副流感嗜血杆菌，而中度和重度支扩症患者则为铜绿假单胞菌。25例轻度支扩症急性加重期患者中3例痰液标本中检出病毒，其中鼻病毒2例，甲型流感病毒（年甲型H1N1）和副流感病毒（1~3型）混合感染1例；鼻拭子标本中7例检出病毒，甲型流感病毒4例（其中1例为年甲型H1N1），冠状病毒2例，鼻病毒1例；中度支扩症急性加重期痰液中13例检出病毒，其中冠状病毒6例，呼吸道合胞病毒3例，甲型流感病毒2例（其中1例为年甲型H1N1），乙型流感病毒1例，鼻病毒1例；鼻拭子中检出病毒13例，其中冠状病毒6例，甲型流感病毒2例（其中1例为年甲型H1N1），鼻病毒和冠状病毒混合感染1例，鼻病毒和呼吸道合胞病毒混合感染1例，鼻病毒、乙型流感病毒和副流感病毒单独感染各1例；重度支扩症急性加重期19例痰液中检出病毒，其中鼻病毒8例，甲型流感病毒3例（其中1例为年甲型H1N1），冠状病毒3例，肠道病毒和呼吸道合胞病毒混合感染1例，肠道病毒和鼻病毒混合感染1例，鼻病毒和甲型流感病毒混合感染1例，腺病毒、鼻病毒和冠状病毒混合感染1例，偏肺病毒1例；鼻拭子中19例检出病毒，其中甲型流感病毒6例（其中1例为年甲型H1N1），鼻病毒和甲型流感病毒混合感染1例，鼻病毒3例，鼻病毒和冠状病毒E混合感染1例，鼻病毒、冠状病毒OC43、冠状病毒E混合感染1例，冠状病毒3例，呼吸道合胞病毒2例，偏肺病毒、腺病毒单独感染各1例，见表3。

表3不同严重程度支扩症患者急性加重期病原学特征（例，%）

3．不同病原菌所致急性加重对全身炎症指标和住院率的影响：

次急性加重事件中25次未分离出致病微生物，26次仅分离出细菌，19次仅分离出病毒，30次同时分离出细菌和病毒（表4）。本研究中痰液或鼻拭子标本之一检测出病毒者即定义为病毒感染，同时发现病毒和细菌混合感染患者的血清C反应蛋白水平显著高于单纯病毒感染和无病原微生物感染的患者，差异有统计学意义（H=23.32，P0.01）；同时分离出病毒和细菌患者的血清IL-8水平高于未分离出病原微生物的患者（U=.5，P=0.）。细菌和病毒感染、单纯细菌感染、单纯病毒感染及无病原微生物感染的患者需要住院的比例分别为30.0%（9/30）、19.2%（5/26）、5.6%（1/18）和0，混合感染较单纯病毒感染和无病原微生物感染患者的住院率高，差异有统计学意义（χ2=4.4，P=0.04；χ2=9.0，P=0.），见表4。

表4不同病原谱所致急性加重患者炎性指标结果

讨论

支扩症作为我国常见的气道疾病，病程中常出现反复的急性加重，但对急性加重的危险因素知之甚少[5]。本研究结果显示，急性加重期痰液和鼻拭子中病毒检出率均高于稳定期患者，常见的病毒为冠状病毒、鼻病毒和流感病毒；进一步通过支扩症严重程度指数进行病情严重程度分级，发现中度和重度支扩症患者痰液中病毒检出率明显高于病情较轻的患者。而细菌的检出率在稳定期和急性加重期并没有差别。对于病毒感染触发支扩症急性加重的机制尚不清楚，可能包括支扩症上皮细胞先天免疫功能障碍和干扰气道内细菌定植等有关，这也部分解释了中度和重度支扩症急性加重期痰液病毒感染率高于轻度支扩症患者的现象。

值得注意的是，本研究结果显示支扩症急性加重期鼻拭子和痰液呼吸道病毒的阳性率不同。对急性加重期鼻拭子和痰液检测病毒结果进行一致性检验后发现，鼻拭子和痰标本在诊断病毒所致的支扩症急性加重的一致性较为一般。在例次囊性纤维化急性加重事件的前瞻性研究中[12]，痰液、鼻拭子和咽拭子检测出的病毒分别占病毒所致急性加重（3种标本类型任意一种检出病毒即定义为病毒所致急性加重）的58.0%、46.7%和43.3%，联合痰液和上气道标本进行病毒检测可最大程度增加病毒检出的可能性。另外，越来越多的证据显示[13,14]，病毒性上呼吸道感染是触发慢阻肺急性加重的重要危险因素，约有40%~60%的慢阻肺急性加重与病毒性上呼吸道感染相关。对成人支扩症患者来讲，尽管痰液是急性加重期易于获得的标本，但补充鼻拭子进行联合检测对于支扩症急性加重期病毒感染的监测具有重要的意义。

支扩症患者气道内常有细菌定植，本研究结果显示急性加重期细菌检出的比例超过50%，主要的致病菌是铜绿假单胞菌，而流感嗜血杆菌的比例较低。Venning等[15]对61例住院的支扩症急性加重患者的病原学进行调查后发现，铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌是常见的细菌类型。我国关于慢阻肺急性加重期细菌构成的流行病学调查结果显示，铜绿假单胞菌是最常见的细菌类型[16]。我国慢性气道疾病患者下呼吸道铜绿假单胞菌的检出率较高，可能与抗生素使用不规范有关；另外，许多非呼吸专科医生往往仅凭患者有咳痰症状即开始给予抗生素治疗，致使许多稳定期支扩症患者常接受不规范的口服抗生素治疗，间接造成铜绿假单胞菌分离比例较高。根据BSI评分的严重程度分级，我们发现轻度支扩症患者急性加重期痰液中分离的主要细菌是副流感嗜血杆菌，中度和重度支扩症患者主要分离的细菌是铜绿假单胞菌，因此根据病情的严重程度评估急性加重期的病原菌对指导抗生素的选择具有一定意义。支扩症急性加重期细菌的种类与稳定期比较无明显差异，细菌在支扩症急性加重期的作用值得进一步探讨。通过PCR方法检测细菌的负荷及利用16S-DNA测序的方法探讨急性加重期气道菌群结构的变化[17,18]，对于了解细菌在支扩症急性加重期的作用具有重要意义。

支扩症急性加重常伴有急性全身炎症反应[19,20]，不同的病原菌所致急性加重对于全身炎症反应的影响尚不清楚。本研究发现，病毒和细菌混合感染患者血清C反应蛋白和IL-8水平高于无细菌和病毒分离组，同时混合感染患者血清C反应蛋白水平明显高于单纯病毒感染患者，提示混合感染患者的全身炎症反应较重。与之对应的是，混合感染所致急性加重需要住院治疗的比例明显高于单纯病毒感染和无病原微生物感染的患者。这些结果表明，细菌和病毒混合感染常诱发较为严重的全身炎症反应，这可能是混合感染患者住院比例较高的原因之一。

目前国内外对于支扩症急性加重的定义尚未完全明确，同时缺乏客观指标，本研究采用前瞻性随访的方法，所有患者的痰标本均在采集后2h内进行接种，所有程序均严格按照广州呼吸健康研究院细菌室的标准进行，从而保证了研究结果的可信性。但本研究为单中心研究，样本量相对较小，组织全国多中心大规模流行病学调查可提供更详细的数据，进而指导临床；采用传统培养的方法进行细菌学检测，无法对比急性加重期和稳定期细菌的负荷及菌群变化，难以深入了解细菌感染在支扩症急性加重中的作用。如何区分急性加重期气道内分离出的病原菌是新近感染还是定植，目前国内外尚缺乏统一标准，值得进一步研究；支扩症急性加重期分离出病毒的意义尚不清楚，其对于患者急性加重期恢复时间的影响需要更多研究；本研究主要入组的是门诊支扩症患者，对于住院的支扩症患者急性加重期的病原谱分布及对住院时间的影响值得进一步探讨。

综上所述，本研究结果表明，支扩症急性加重期患者病毒检出率高于稳定期，而细菌的检出率无明显差异。轻度支扩症患者急性加重期分离出的主要细菌是副流感嗜血杆菌，主要病毒是甲型流感病毒；中度和重度支扩症患者则为铜绿假单胞菌，病毒是鼻病毒；病毒和细菌混合感染患者全身炎症反应较重且住院比例较高。这些结果表明，评估不同严重程度支扩症患者急性加重期病原谱对于疾病的预防和治疗具有重要意义。

志谢

志谢　呼吸疾病国家重点实验室的刘文宽博士协助病毒PCR检测

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

（参考文献略）

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